Клиника МАМА, Москва
Разработан метод мультипротекторной витрификации ооцитов и показана его клиническая эффективность. Преимуществом данного метода является сочетание четырех различных криопротекторов в пониженных концентрациях, благодаря чему происходит уменьшение токсического эффекта каждого из компонентов при сохранении необходимого суммарного содержания, а также многоэтапная проводка ооцитов по витрификационным растворам, что обеспечивает эффективное замещение жидкости с наименьшим осмотическим повреждением. Мультипротекторная витрификация ооцитов успешно применяется в Клинике МАМА для формирования криобанка яйцеклеток доноров.
Начало использования метода витрификации в эмбриологической практике Клиники МАМА было положено в 2000 г. В результате применения разработанной нами методики витрификации эмбрионов человека в декабре 2002 г. родился первый в России ребенок после размораживания эмбрионов, криоконсервированных данным методом [60]. С тех пор витрификация эмбрионов в Клинике МАМА стала рутинной процедурой [48, 51].
Не менее актуальной для клиник ВРТ является задача криоконсервации ооцитов [7, 27, 39, 44, 46, 55]. Необходимость проведения данной процедуры может быть обусловлена как медицинскими или социальными показаниями, так и высокой потребностью в создании криобанков донорских ооцитов [13, 15, 40, 43, 50]. Однако процесс криоконсервации ооцитов сильно затруднен по сравнению с криоконсервацией эмбрионов. Это связано с рядом цитологических и молекулярно-биохимических особенностей ооцита, принципиально отличающих его от эмбриональной клетки [8, 17, 18, 26, 38, 45].
О первой беременности после переноса эмбрионов, полученных от замороженных ооцитов, было сообщено еще в 1986 г. в Австралии [11]. Тем не менее в течение десятилетия после этого в данной области не было получено значимых результатов. Выживаемость ооцитов после криоконсервации оставалась крайне низкой, были получены лишь единичные беременности [1, 22, 41, 47].
Прорывом в криоконсервации ооцитов, так же как и в криоконсервации эмбрионов, стало начало применения метода витрификации. Первые сообщения об эффективности данного метода при криоконсервации ооцитов начали появляться с 1999 г. [33, 34]. В настоящее время во многих лабораториях мира активно ведутся работы по оптимизации метода витрификации ооцитов, функционируют первые криобанки донорских яйцеклеток [15, 20, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 40, 43, 44, 50, 55, 57].
Нами был разработан и внедрен в практику метод мультипротекторной (multiprotectant) витрификации ооцитов. Защитный эффект метода достигается за счет увеличения криопротекторного состава до четырех действующих компонентов, а также в результате многоступенчатой экспозиции ооцитов в растворах криопротекторов при витрификации и в растворах сахарозы при размораживании. В ноябре 2010 г. в Клинике МАМА начато создание криобанка ооцитов анонимных доноров с целью проведения программ ЭКО пациенткам клиники, нуждающимся в донации яйцеклеток.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для создания банка донорских яйцеклеток были использованы ооциты анонимных доноров. Критерием отбора доноров были: возраст от 20 до 35 лет; наличие собственного здорового ребенка; отсутствие выраженных фенотипических проявлений; соматическое здоровье. Донорство ооцитов осуществлялось при наличии письменного информированного согласия донора на проведение индукции суперовуляции и пункции яичников (Приказ Минздрава РФ №67 от 26.02.03 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия»).
Индукцию суперовуляции анонимным донорам проводили со 2—3-го дня менструального цикла по короткому или длинному протоколу с использованием препаратов Декапектила-дейли 0.1 («Ferring», Германия) и Менопура («Ferring», Германия). Средняя стартовая доза гонадотропинов составляла 100—150 МЕ, средняя общая доза – 1000—1500 МЕ. Трансвагинальную пункцию яичников проводили на 12— 14-й день стимулированного цикла.
Полученные в результате трансвагинальной пункции анонимных доноров ооциты инкубировали в среде Cleavage medium («Cook», Ирландия) в стандартных условиях (37 °C; газовая смесь: 5% СО2 , 5% О2, 90% N2 ) в течение 3—6 ч. По истечении указанного времени ооциты освобождали от клеток cumulus oophorus и coronae radiatae, используя фермент гиалуронидазу («Sigma», Германия). После ферментативной обработки оценивали качество и степень зрелости ооцитов. Пригодными для витрификации считали ооциты M-II нормальной морфологии без признаков дегенерации.
В ходе криоконсервации ооциты последовательно проводили по трем растворам криопротекторов с восходящей концентрацией следующего состава: этиленгликоль («Fluka», Швейцария) 3,75—15%; диметилсульфоксид — ДМСО («Sigma», Германия) 3,75—15%; фиколл («Sigma», Германия) — 2,5—10%; сахароза («Sigma», Германия) — 0,125—0,5 М при температуре –37 °C. Время экспозиции ооцитов в каждом растворе варьировало от 1 до 6 мин. После экспозиции в последнем растворе криопротекторов ооциты в количестве 2—3 помещали в систему HSV kit («CryoBioSystem», Франция). Криоконсервацию осуществляли путем мгновенного погружения системы HSV в кипящий азот (–196 °С) с последующим хранением в сосудах Дьюара от 3 дней до 2 мес.
Для размораживания ооцитов систему HSV извлекали из кипящего азота, после чего кончик системы мгновенно погружали в первый раствор для размораживания и далее ооциты последовательно проводили по трем растворам сахарозы с нисходящей концентрацией (1М—0,125М) при 37 °C. Время экспозиции в каждом растворе составляло 1 мин. После размораживания ооциты инкубировали в среде Cleavage medium («Cook», Ирландия) в стандартных условиях в течение 3 ч. По истечении указанного времени ооциты оплодотворяли методом ИКСИ с использованием спермы мужей пациенток-реципиентов.
При оценке результатов оплодотворения зиготы были разделены на две группы: с нормальным оплодотворением (в цитоплазме визуализируются два пронуклеуса), с аномальным оплодотворением (более двух пронуклеусов) или отсутствием оплодотворения (нет пронуклеусов). Культивирование эмбрионов осуществляли в стандартных условиях последовательно в средах Cleavage medium («Cook», Ирландия), Blastocyst medium («Cook», Ирландия) в течение 5 сут до стадии бластоцисты.
Подготовку пациенток-реципиентов к трансплантации эмбрионов проводили в рамках менструального цикла с применением заместительной гормональной терапии с 3—5-го дня менструального цикла. В первую фазу цикла использовали эстрогенсодержащие препараты дивигель 0,1% («Orion Corporation») и прогинова («Bayer») по отдельности или в сочетании друг с другом. Динамический ультразвуковой мониторинг проводили на 8-й и 12—14-й дни менструального цикла с повышением дозы эстрогенов при необходимости.
Внутриматочную трансплантацию эмбрионов осуществляли на 5-е сутки развития синхронно с циклом реципиента. Пациентке трансплантировали не более двух эмбрионов, оставшиеся эмбрионы хорошего качества криоконсервировали. Оценку качества эмбрионов перед трансплантацией и криоконсервацией осуществляли, используя систему классификации Гарднера [21]. После переноса эмбрионов поддержка лютеиновой фазы включала препараты прогестерона: утрожестан («Laboratoires Besins International»), дюфастон («Solvay Pharmaceuticals B.V.»), раствор прогестерона масляный («ФармаДон»), витаминотерапию и сосудистые препараты. В лютеиновой фазе цикла проводили гормональный мониторинг для оценки адекватности терапии в день внутриматочной трансплантации эмбрионов и на 5—7-й день после переноса. Анализ крови на β-чХГ проводили на 14-й день после внутриматочной трансплантации эмбрионов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В период c ноября 2010 г. по февраль 2011 г. в Клинике МАМА методом мультипротекторной (multiprotectant) витрификации было заморожено 230 ооцитов, полученных от 33 анонимных доноров. Всего за этот период было проведено 14 программ ЭКО с использованием витрифицированных донорских ооцитов, в которых было разморожено 72 ооцита. После размораживания 5 (6,9%) из 72 ооцитов дегенерировали, 6 (93,1%) ооцитов не имели признаков дегенерации. Все 67 размороженных ооцитов нормальной морфологии оплодотворяли методом ИКСИ с использованием спермы мужей пациенток-реципиентов. Нормальное оплодотворение было зафиксировано в 54 (80,6%) ооцитах, все полученные 54 зиготы к 48 ч после оплодотворения вступили в дробление.
Всего к 5-м суткам культивирования было получено 24 (44,4%) перспективных для переноса эмбриона. В 9 циклах ЭКО с использованием витрифицированных ооцитов доноров была осуществлена внутриматочная трансплантация перспективных эмбрионов.
Каждой пациентке трансплантировали не более двух эмбрионов (в 6 случаях — по два эмбриона, в 3 — по одному эмбриону). В 4 случаях были криоконсервированы избыточные перспективные эмбрионы (всего 9 эмбрионов). На 14-е сутки после трансплантации эмбрионов положительное значение β-чХГ в крови было определено у 4 из 9 пациенток. Все 4 беременности были подтверждены клинически (28,6% на цикл — 4/14), (44,4% на перенос — 4/9) и в настоящее время развиваются; из них одна беременность двойней, три беременности — одноплодные.
Клинические и лабораторные результаты, а также данные об эффективности мультипротекторной витрификации в Клинике МАМА представлены в таблице
ОБСУЖДЕНИЕ
Технология замораживания эмбрионов уже давно стала рутинной, в отличие от криоконсервации ооцитов человека, которая долгие годы представляла большие трудности. Основной проблемой при криоконсервации ооцитов является то, что зрелые ооциты находятся на стадии метафазы II, которая характеризуется наличием активного аппарата веретена деления. Веретено деления ооцита крайне чувствительно к воздействию низких температур. При снижении температуры происходит стремительная деполимеризация микротрубочек веретена, что может привести к неправильной сборке веретена после размораживания и, как следствие, к нарушению расхождения хромосом при делении яйцеклетки после размораживания [2, 8, 17, 18, 26, 38]. Другим важным фактором является крайне низкая эффективность проникновения криопротектора через плазматическую мембрану ооцита. По сравнению с объемом бластомеров яйцеклетка имеет гораздо больший объем цитоплазмы и меньшее соотношение площади поверхности к объему. Таким образом, площадь проникновения криопротекторов через плазматическую мембрану яйцеклетки критически мала по отношению к объему замещаемой криопротектором внутриклеточной жидкости. По этой причине криопротекторный состав сред для замораживания эмбрионов не является достаточным для эффективной криоконсервировации ооцитов. Кроме того, основным овреждающим фактором для любых клеток в процессе заморозки и особенно разморозки является формирование кристаллов льда внутриклеточной водой [59].
Указанные проблемы в той или иной степени были успешно разрешены в результате применения для криоконсервации ооцитов метода витрификации, который практически полностью исключает формирование кристаллов льда (происходит быстрый переход вещества в аморфное состояние) и сводит к минимуму механическое повреждение клеток [12, 28, 56]. В настоящее время данный метод во всем мире находится на начальных этапах своего развития: ограничено количество вариантов криопротекторного состава сред для витрификации; невысоко предложение коммерческих продуктов для замораживания ооцитов; мало данных о рождении детей после программ ЭКО с использованием криоконсервированных ооцитов.
Первое сообщение о рождении ребенка после витрификации ооцитов появилось в 1999 г. [33], в работе были использованы витрификационные среды, состоящие из двух криопротекторов: этиленгликоля и сахарозы. Новейшим этапом в усовершенствовании метода витрификации ооцитов стало увеличение числа криопротекторов в составе сред для витрификации. Примером наиболее успешного использования трехкомпонентного состава витрификационных сред (этиленгликоль, ДМСО, сахароза) стал Сryotop метод [36]: при сочетании различных криопротекторов в низких концентрациях достигается их необходимая суммарная концентрация и происходит снижение токсического эффекта каждого из компонентов [3, 6, 9, 34, 35, 52]. В разработанных нами мультипротекторных средах для витрификации ооцитов мы используем сразу четыре криопротектора в низких концентрациях: этиленгликоль, ДМСО, сахарозу, фиколл.
Другой отличительной особенностью разработанного нами метода мультипротекторной витрификации является многоэтапная инкубация ооцитов в витрификационных средах, что обеспечивает постепенное повышение концентрации криопротекторов и меньшую экспозицию ооцитов в каждом из концентрированных растворов. Последовательная проводка яйцеклеток по четырем растворам криопротекторов восходящей концентрации при витрификации, а также последовательная инкубация в четырех растворах нисходящей концентрации сахарозы при размораживании обеспечивают эффективную дегидратацию/гидратацию с наименьшим осмотическим повреждающим эффектом.
По современным данным, при использовании метода витрификации ооцитов процент выживания ооцитов составляет от 78,9 до 99,4% (при использовании метода мультипротекторной витрификации в Клинике МАМА — 93,1%); частота оплодотворения при использовании техники ИКСИ от 71,7 до 92,9% (в Клинике МАМА — 80,6%); частота дробления на 2-е сутки от 84 до 98% (в Клинике МАМА — 100%); частота образования перспективных эмбрионов на 5-е сутки культивирования от 41 до 56% (в Клинике МАМА — 44,4%); частота наступления клинической беременности на перенос составляет от 18,2 до 83,3% (в Клинике МАМА — 44,4%); процент продолжающихся беременностей от 30,8 до 65% (в Клинике МАМА — 44,4%); частота имплантации от 9,3 до 61,9% (в Клинике МАМА — 33,3%) [4, 5, 10, 13, 14, 16, 19, 24, 32, 36, 37, 42, 49, 53, 54, 58].
Таким образом, представленные нами предварительные результаты (см. таблицу) сопоставимы с опубликованными данными, полученными при использовании альтернативных протоколов витрификации. Разработанная нами методика мультипротекторной витрификации яйцеклеток показала стабильную эффективность, что позволило нам приступить к формированию банка криоконсервированных ооцитов доноров.
ЛИТЕРАТУРА
1. Al-Hasani S., Diedrich K., Van der Ven H. et al. Cryopresrvation of human oocytes. Human Reprod 1987; 2: 695—700.
2. Alikani M., Cohen J. Human oocyte and embryo cryopreservation. Curr Opin Obstet Gynecol 1990; 2: 5: 714—717.
3. Ali J., Shelton J.N. Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos. J Reprod Fertil 1993; 99: 2: 471—477.
4. Almodin C.G., Minguetti-Camara V.C., Paixao C.L., Pereira P.C. Embryo development and gestation using fresh and vitrified
oocytes. Hum Reprod 2010; 25: 5: 1192—1198.
5. Antinori M., Licata E., Dani G. et al. Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries. Reprod Biomed Online 2007; 14: 1: 72—79.
6. Baudot A., Odagescu V. Thermal properties of ethylene glycol aqueous solutions. Cryobiology 2004; 48: 283—294.
7. Bernard A., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives. Hum Reprod Update 1996; 2: 3: 193—207.
8. Boiso I., Marti M., Santalo J. et al. A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum Reprod 2002; 17: 7: 1885—1891
9. Boutron P., Peyridieu J.F. Reduction in toxicity for red blood cells in buffered solutions containing high concentrations of 2,3-butanediol by trehalose, sucrose, sorbitol, or mannitol. Cryobiology 1994; 31: 4: 367—373.
10. Chang C.C., Shapiro D.B., Bernal D.P. et al. Human oocyte vitrification: in-vivo and in-vitro maturation outcomes. Reprod Biomed Online 2008; 17: 5: 684—688.
11. Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet 1986; 1: 884—886.
12. Chen C., Li W. Diffusion controlled ice growth with sofimpingement inside biological cells during freezing. Cryo Letter2008; 29: 5: 371—381.
13. Cobo A., Domingo J., Pérez S., Crespo J., Remohí J., Pellicer A Vitrification: an effective new approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients. Clin Transl Oncol 2008; 105: 268—273.
14. Cobo A., Kuwayama M., Pérez S. et al. Comparison of concomitan
outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocyte vitrified by the Cryotop method. Fertil Steril 2008; 89: 6: 1657—1664.
15. Cobo A., Meseguer M., Remohí J., Pellicer A. Use of cryo-banked
oocytes in an ovum donation programme: a prospective randomized, controlled, clinical trial. Hum Reprod 2010; 25: 9 2239—2246.
16. Cobo A., Romero J.L., Pérez S. et al. Storage of human oocytes in
the vapor phase of nitrogen. Fertil Steril 2010; 94: 5: 1903—1907.
17. Cobo A., Rubio C., Gerli S. et al. Use of fluorescence in situ hybridization to assess the chromosomal status of embryos obtained from cryopreserved oocytes. Fertil Steril 2001; 75: 354—360.
18. Coticchio G., Bromfield J.J., Sciajno R. et al. Vitrification ma increase the rate of chromosome misalignment in the metaphase I spindle of human mature oocytes. Reprod Biomed Online 2009 19: Suppl 3: 29—34.
19. Fadini R., Brambillasca F., Renzini M.M. et al. Human oocyt cryopreservation: comparison between slow and ultrarapid methods. Reprod Biomed Online 2009; 19: 2: 171—180.
20. García J.I., Noriega-Portella L., Noriega-Hoces L. Efficacy o oocyte vitrification combined with blastocyst stage transfer in an egg donation program. Hum Reprod 2011.
21. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts.
In: Towards reproductive certainty: fertility and genetics beyond 1999. Eds. R. Jansen, D. Mortimer. Carnfort, UK: Parthenon Publishing 1999; 378—388.
22. Gook D., Osborn S., Johnston W. Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the configuration of the
meiotic spindle. Hum Reprod 1993; 8: 1101—1109.
23. Grifo J., Noyes N. Delivery rate using cryopreserved oocytes is comparable to conventional in vitro fertilization using fresh oocytes: potential fertility preservation for female cancer patients. Fertil Steril 2010; 93: 391—396.
24. Hunter J.E., Fuller B.J., Bernard A. et al. Vitrification of human oocytes following minimal exposure to cryoprotectants; initial studies on fertilization and embryonic development. Hum Reprod 1995; 10: 5: 1184—1188.
25. Imoedemhe D.G., Sigue A.B. Survival of human oocytes cryopreserved with or without the cumulus in 1,2-propanediol. J Ass Reprod Genet 1992; 9: 4: 323—327.
26. Isachenko E.F., Nayudu P.L. Vitrification of mouse germinal vesicle oocytes: effect of treatment temperature and egg yolk on chromatin and spindle normality and cumulus integrity. Hum Reprod 1999; 14: 2: 400—408.
27. Jain J. et al. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2005; 86: 4: 1037—1046.
28. Karlsson J.O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology 2001; 42: 3: 154—169.
29. Katayama K., Stehlik J., Kuwayama M. et al. High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertil Steril 2003; 223—224.
30. Kazem R., Thompson L.A., Srikantharajah A. et al. Cryopreservation
of human oocytes and fertilization by two techniques: in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1995; 10: 10: 2650—2654.
31. Kim T.J., Hong S.W. Successful live birth from vitrified oocytes after 5 years of cryopreservation. J Ass Reprod Genet 2010.
32. Kim T.J., Laufer L.R., Hong S.W. Vitrification of oocytes produces high pregnancy rates when carried out in fertile women. Fertil Steril 2010; 93: 2: 467—474.
33. Kuleshova L., Gianaroli L., Magli C. et al. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 1999; 14: 12: 3077—3079.
34. Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M. Sugars exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have low toxicity to embryos and oocytes. Cryobiology 1999; 38: 2: 119—130.
35. Kuleshova L.L., Shaw J.M., Trounson A.O. Studies on replacing most of the penetrating cryoprotectant by polymers for embryo cryopreservation. Cryobiology 2001; 43: 1: 21—31.
36. Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online 2005; 11: 3: 300—308.
37. Levran D., Dor J., Rudak E. et al. Pregnancy potential of human oocytes — the effect of cryopreservation. N Engl J Med 1990; 323: 17: 1153—1156.
38. Mandelbaum J., Anastasiou O., Levy R. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004; 113S: S17—S23.
39. Mandelbaum J., Junca A.M., Plachot M. et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes. Hum Reprod 1988; 3: 1: 117—119.
40. Manipalviratn S., Decherney A. Clinical application of human oocyte cryopreservation. Rev Recent Clin Trials 2008; 3: 2: 104—110.
41. Nawroth F., Kissing K. Pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) of cryopreserved human oocytes. Acta Obstet Gynecol Scand 1998; 77: 4: 462—463.
42. Noyes N., Knopman J., Labella P. et al. Oocyte cryopreservation outcomes including pre-cryopreservation and post-thaw meiotic spindle evaluation following slow cooling and vitrification of human oocytes. Fertil Steril 2010; 94: 6: 2078—2082.
43. Noyes N., Labella P.A., Grifo J., Knopman J. Oocyte cryopreservation:
a feasible fertility preservation option for reproductive age cancer survivors. M J Ass Reprod Genet 2010; 27: 8: 495—499.
44. Noyes N., Porcu E., Borini A. Over 900 oocyte cryopreservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies. Reprod Biomed Online 2009; 18: 6: 769—776.
45. Pickering S.J., Johnson M.H. The influence of cooling on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocyte. Hum Reprod 1987; 2: 3: 207—216.
46 Porcu E. Freezing of oocytes. Curr Opin Obstet Gynecol 1999; 11: 3: 297—300.
47. Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. et al. C. Birth of a healthy female
after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil Steril 1997; 68: 4: 724—726.
48. Potapov M., Zaeva V., Shafei R. et al. Krivokharchenko I., Zaletov S.
IVF children after vitrification. Abstracts of the 22nd Annual Meeting of the ESHRE. Prage (Czech republic) 2006.
49. Rienzi L., Romano S., Albricci L. et al. Embryo development of fresh ’versus’ vitrified metaphase II oocytes after ICSI: a prospective randomized sibling-oocyte study. Hum Reprod 2010; 25: 1: 66—73.
50. Scaravelli G., Vigiliano V., Mayorga J.M. et al. Analysis of oocyte cryopreservation in assisted reproduction: the Italian National Register data from 2005 to 2007. Reprod Biomed Online 2010; 21: 4: 496—500.
51. Shafei R., Zaeva V., Krivokharchenko I., Isaev D. Vitrification of human embryos using hyaluronan-based protocol: clinical outcome of 118 cycles. Abstracts of the 20th Annual Meeting of the ESHRE. Human Reprod 2004; i136.
52. Shaw J.M., Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O. Vitrification properties of solutions of ethylene glycol in saline containing PVP, Ficoll, or dextran. Cryobiology 1997; 35: 3: 219—229.
53. Sher G., Keskintepe L., Mukaida T. et al. Selective vitrification of euploid oocytes markedly improves survival, fertilization and pregnancy-generating potential. Reprod Biomed Online 2008; 17: 4: 524—529.
54. Smith G.D., Serafini P.C., Fioravanti J. et al. Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow-rate freezing or vitrification. Fertil Steril 2010; 94: 6: 2088—2095.
55. Tao T., Zhang W., Del Valle A. Human oocyte cryopreservation. Curr Opin Obstet Gynecol 2009; 21: 3: 247—252.
56. Trounson A., Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight cell embryo. Nature 1983; 305: 707—709.
57. Yoon T.K., Kim T.J., Park S.E., Hong S.W., Ko J.J., Chung H.M., Cha K.Y. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 2003; 79: 6: 1323—1326.
58. Yoon T.K., Lee D.R., Cha S.K. et al. Survival rate of human oocytes and pregnancy outcome after vitrification using slush nitrogen in assisted reproductive technologies. Fertil Steril 2007; 88: 4: 952—956.
59. Пушкарь Н.С., Белоус А.М. Введение в криобиологию. Киев: Наукова думка 1975.
60. Заева В.В., Кривохарченко И.С., Сухачева Т.С., Шафеи Р.А. Роды после ЭКО с переносом витрифицированных эмбрионов (описание случая). Пробл репрод 2003; 2: 63—64.