Статья была опубликована в журнале «Проблемы репродукции» № 5, 2009.
Авторы: к.б.н., эмбриолог Д.А. Исаев, вр.-репродуктолог В.В. Заева, эмбриолог Р.В. Бакурадзе, эмбриолог И.С. Кривохарченко, вр.-репродуктолог С.Ю. Залетов
В настоящее время замораживание в жидком азоте является единственным надежным и широко распространенным способом хранения спермы человека и животных. В конце 40-х г.г. прошлого века C. Polge и соавт. [1] успешно применили глицерин в качестве криопротектора для замораживания спермы животных. Криоконсерванты на основе глицерина по сей день остаются лучшими, обеспечивая достаточно высокую выживаемость спермы после размораживания.
Криоконсервация в жидком азоте имеет недостатки, наиболее существенным из которых является транспортировка, в т.ч. авиатранспортировка с преодолением таможенных границ, что требует соблюдения строгих ограничений при использовании жидкого азота.
Часто в практике ЭКО требуется сохранение спермы в течение нескольких дней или недель. В этих случаях биохимическая консервация без замораживания в жидком азоте могла бы стать более простым и экономичным способом хранения. Допускается также использование этого подхода для так называемого «накопительного» хранения спермы пациентов с олигозооспермией с целью проведения последующей искусственной инсеминации [2].
Предложенный в 1996 г K. Saito и соавт. новый способ хранения спермы человека при +4 0C в бессолевом водном растворе глюкозы является, очевидно, наиболее эффективным способом хранения без замораживания [3]. Механизм поддержания жизнеспособности спермы в такой безэлектролитной среде (БЭС) не ясен; возможно, что, при блокировании на холоде Na+/K±АТФазы и в отсутствие электролитических ионов, глюкоза в изотонической концентрации препятствует гипоосмотическому поражению.
По разным оценкам исследователей, в организме млекопитающих сперматозоиды могут сохраняться в cauda epididymis от нескольких дней до нескольких недель [4] при температурах, лишь незначительно ниже температуры тела. Одним из путей сохранения спермы без замораживания является имитация условий сохранения в эпидидимисе, что подразумевает разработку сходных биохимических составов и/или поиск специфических ингибиторов метаболизма [5-7].
В клетках эпителия эпидидимиса человека установлена высокая активность альдозоредуктазы и сорбитолдегидрогеназы, превращающих глюкозу во фруктозу; эти два фермента присутствуют также в эпидидимосомах, поступающих в просвет эпидидимиса апокринным путем [8]. Исходя из этого, мы предположили, что хранение в растворе фруктозы более соответствует естественному состоянию покоя сперматозоидов в эпидидимисе.
Материал и методыИспользовали 22 образца капацитированной спермы, оставшейся после выполнения фертилизации in vitro в программах лечения бесплодия. Сперма была подготовлена с использованием набора «SupraSperm System» (MediCult, Дания) в соответствии с прилагаемой инструкцией [9]. После разделения в градиенте плотности супернатант удаляли, осадок растворяли в 3 мл среды «FertiCult Flushing medium» (FertiPro, Бельгия) и повторно центрифугировали.
Для консервации использовали среду БЭС по Saito и соавт., представляющую собой водный раствор 0,33 М глюкозы и 3 % БСА [2,3], а также среду БЭС-Ф, где глюкоза была заменена на фруктозу в той же концентрации. Осмоляльность среды измеряли на осмометре «ОМКА 1Ц-01» и доводили моносахаридом до 320 мОсм/кг. По 30 мкл отмытого осадка сперматозоидов каждого образца помещали в стерильные пробирки и разводили, соответственно, в 2 мл БЭС и БЭС-Ф. Пробирки с образцами помещали в холодильник и хранили при температуре +4 0С в течение 2 недель.
После хранения образцы осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 300 G, аккуратно удаляли консервант и растворяли осадок в 100 мкл среды «FertiCult IVF medium» (FertiPro Бельгия). Полученную суспензию сперматозоидов разводили той же средой до концентрации 0,1 млн/мл и инкубировали в течение 2 ч при +37 0С в атмосфере трехгазовой смеси (5 % CO2; 5 % O2; 90 % N2).
Подвижность сперматозоидов определяли в соответствии с рекомендациями ВОЗ [10], подсчитывали также долю сперматозоидов с признаками гипоосмотического поражения.
Результаты представлены в виде M ± m, где М — среднее, m — стандартная ошибка среднего. Оценку различий в подвижности и гипоосмотическом поражении после хранения в двух консервантах проводили по парному Т-критерию Вилкоксона. Для выявления связи между показателями жизнеспособности после ревитализации и исходными показателями нативного эякулята применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Расчеты и подготовку иллюстративного материала выполняли с использованием пакета программ STATISTICA 5.0 (StatSoft, Inc.)
Результаты и обсуждение
Восстановление подвижности. Восстановление подвижности после ревитализации в среде «FertiCult IVF medium» наблюдали в течение 2 ч, поскольку инкубация в течение более длительного времени не приводит к увеличению числа подвижных сперматозоидов. При подсчете учитывали только сперматозоиды с поступательным движением (категории А и B).
Обработка спермы в двухступенчатом градиенте плотности обеспечивает присутствие в исходной суспензии не менее 80 % прогрессивно-подвижных сперматозоидов [11], поэтому мы не проводили дополнительной оценки подвижности в образцах непосредственно перед консервацией.
Подвижность после хранения в БЭС и БЭС-Ф составила 56,2 ± 5,0 % и 42,6 ± 4,7 % (N = 22) соответственно (рис.1.). По парному Т-критерию Вилкоксона для α = 5 %, установлены достоверные различия между процентным содержанием подвижных сперматозоидов в образцах после хранения в БЭС и БЭС-Ф (Т = 1,0; N = 22; р = 0,00).
Гипоосмотическое поражение. В гипоосмотических условиях у сперматозоидов наблюдается характерное скручивание жгутика в результате разрушения или растяжения мембраны жгутиковой части. Это свойство сперматозоидов используется в качестве теста на жизнеспособность — HOST (англ. hypo-osmotic swelling test — тест на гипоосмотическое разбухание) [12]. В результате хранения на холоде без замораживания и последующей ревитализации у спермы также наблюдаются характерные для гипоосмотического поражения признаки — HOS-формы, несмотря на изотоничность или даже гипертоничность консервирующей среды. Это может происходить по нескольким причинам: снижение на холоде активности Na+/K±АТФазы, диффузия в клетку Na+ и, как следствие, обводнение цитоплазмы; слеживание спермы в процессе хранения и разрушение мембран; осмотические перепады в результате нагревания-охлаждения и смены среды при ревитализации. Таким образом, присутствие HOS-форм может служить показателем устойчивости спермы к хранению.
Содержание HOS-форм после хранения в БЭС и БЭС-Ф составило 5,0 ± 0,6 % и 14,2 ± 3,2 % (N = 22) соответственно (рис.2.). По парному Т-критерию Вилкоксона для α = 5 %, установлены достоверные различия между содержанием HOS-форм в образцах после хранения в БЭС и БЭС-Ф (Т = 1,0; N = 22; р = 0,00). При хранении в БЭС-Ф относительное количество HOS-форм значительно варьирует, но в среднем почти в 3 раза выше, чем в БЭС.
Индивидуальные особенности спермы. С целью выявить возможное влияние индивидуальных особенностей на сохранение жизнеспособности в разных средах, выбор образцов был произведен случайным образом, без учета качества спермы, а каждый образец был разделен на равные аликвоты для хранения в разных консервантах в одних и тех же условиях.
В полученных нами данных о восстановлении подвижности и наличии HOS-форм наблюдаются индивидуальные различия в устойчивости к хранению вне зависимости от консерванта и показателей нативного эякулята. Установлена сильная корреляция по Спирмену между количеством подвижных сперматозоидов, хранившихся в БЭС и БЭС-Ф (RS = 0,95; N = 22; p = 0,00), а также слабая корреляция между количеством HOS-форм в обоих консервантах (RS = 0,45; N = 22; p = 0,03). В то же время, не установлено корреляции между подвижностью сперматозоидов в нативном эякуляте до обработки и показателями жизнеспособности после хранения в БЭС и БЭС-Ф.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что устойчивость к хранению без заморозки, подобно криорезистентности, является свойством, не связанным с исходной подвижностью и морфологией, но, скорее, с функцией клеточных мембран [13].
Заключение
Консервация и хранение спермы без замораживания в жидком азоте открывает новые возможности для планирования репродуктивных процедур в программах ВРТ. Использование безэлектролитных сред на основе моносахаридов является наиболее эффективным подходом к решению этой задачи. Использованные нами в данной работе консерванты на основе глюкозы и фруктозы обеспечивают хорошую сохранность спермы при +4 0С в течение, по меньшей мере, 2 недель; в то же время, глюкоза является предпочтительной, обеспечивая, в среднем, почти на 14 % более высокую выживаемость по сравнению с фруктозой. Необходимо также отметить, что устойчивость спермы к хранению без замораживания, очевидно, не связана с такими показателями нативного эякулята как объем, подвижность и количество эффективных сперматозоидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Polge C., Smith A.U., Parkers A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 1949; 164: 666.
2. Kanno H., Saito K., Ogawa T., Takeda M. et al. Viability and function of human sperm in electrolyte-free cold preservation. Fertil Steril 1998; 69: 127-131.
3. Saito K., Kinoshita Y., Kanno H. et al. A New method of the electrolyte-free long-term preservation of human sperm at 4°C. Fertil Steril 1996; 65: 1210-1213.
4. Jones R. Sperm survival versus degradation in the Mammalian epididymis: a hypothesis. Biol Reprod 2004; 71: 1405-1411.
5. Setchell B.P., Sanchez-Partida L.G., Chairussyuhur A. Epididymal constituents and related substances in the storage of spermatozoa: a review. Reprod Fertil Dev 1993; 5: 601-612.
6. De Pauw I.M., Van Soom A., Mintiens K. et al. In vitro survival of bovine spermatozoa stored at room temperature under epididymal conditions. Theriogenology 2003; 59: 1093-107.
7. Verberckmoes S., Van Soom A., Dewulf J. et al. Storage of fresh bovine semen in a diluent based on the ionic composition of cauda epididymal plasma. Reprod Domest Anim 2004; 39: 410-416.
8. Frenette G., Thabet M., Sullivan R. Polyol pathway in human epididymis and semen. J Androl 2006; 27: 233-239.
9. http://www.medicult.com
10. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. М.: «МедПресс», 2001. 4-е изд. под. ред. Л.Ф. Курило. 144 с.
11. Söderlund B., Lundin K. The use of silane-coated silica particles for density gradient centrifugation in in-vitro fertilization. Hum Reprod 2000; 15: 857-860.
12. Jeyendran R.S., Zaneveld L.J. Human sperm hypo-osmotic swelling test. Fertil Steril 1986; 46: 151–152.
13. Коренев В.И., Калинина Е.А., Лукин В.А. Криоконсервация сперматозоидов человека. Проблемы репродукции 2000; 6(1): 50-53.
Медицинская Клиника репродукции МАМА info@ma-ma.ru, Москва