Метод витрификации эмбрионов человека был внедрен в эмбриологическую практику Клиники МАМА в 2000 г. В декабре 2002 г. в результате применения разработанной нами методики витрификации родился первый в России ребенок после размораживания эмбрионов, криоконсервированных данным методом [28]. С тех пор витрификация эмбрионов в Клинике МАМА успешно применяется в рутинной практике [23, 25].
Разработка эффективного метода криоконсервации ооцитов в настоящее время является не менее актуальной задачей для клиник ВРТ [2, 12, 18, 21, 22, 26]. Необходимость проведения данной процедуры может быть обусловлена как медицинскими или социальными показаниями, так и высокой потребностью в создании криобанков ооцитов доноров [5, 6, 19, 20, 24]. Однако в сравнении с процессом замораживания эмбрионов криоконсервация яйцеклеток.
значительно затруднена. Это связано с рядом цитологических и молекулярно-биохимических особенностей ооцита, принципиально отличающих его от клеток эмбриона [3, 7, 8, 11, 17]. Несмотря на то что первое сообщение о наступлении беременности после переноса эмбрионов, полученных из замороженных ооцитов, опубликовано еще в 1986 г. [4], долгие годы выживаемость ооцитов после криоконсервации оставалась крайне низкой, были получены лишь единичные беременности [1, 9].
Значимых результатов в области криоконсервации ооцитов удалось достичь благодаря использованию метода витрификации, об эффективности которого при замораживании яйцеклеток впервые было сообщено в 1999 г. [15, 16]. C тех пор во многих лабораториях мира активно ведутся работы по оптимизации метода витрификации ооцитов, функционируют первые криобанки донорских яйцеклеток [6, 10, 12—14, 17, 19, 20, 24, 26, 27, 28].
Нами разработан и внедрен в практику метод мультипротекторной (multiprotectant) витрификации ооцитов. Мультипротекторный эффект достигается за счет увеличения криопротекторного состава до 4 действующих компонентов, а также в результате многоступенчатой экспозиции эмбрионов в растворах криопротекторов при витрификации и в растворах сахарозы при размораживании.
Пациентка М., 44 лет, обратилась в Клинику МАМА. Соматический анамнез и наследственность не отягощены. Из гинекологического анамнеза: менструации регулярные, половая жизнь с 20 лет, наблюдается по поводу бесплодия с 2006 г., одинокая.
В 2005 г. перенесла острый бартолинит, проведено лечение с эффектом. В 2008 г. выявлена миома матки, лечение не проводилось. В ноябре 2009 г. проходила лечение бесплодия методом ЭКО. В результате индукции суперовуляции получен один ооцит. В полость матки перенесен один эмбрион сниженного качества, беременность не наступила. В январе 2010 г. проведена повторная попытка ЭКО с индукцией суперовуляции, получен один ооцит неудовлетворительного качества, программа остановлена. Диагноз: бесплодие первичное. Снижение фолликулярного резерва. Миома матки. Рекомендовано повторное лечение методом ЭКО с использованием ооцитов донора.
В сентябре 2010 г. пациентке проведена программа ЭКО в цикле заместительной гормональной терапии (ЗГТ) с использованием витрифицированных ооцитов анонимного донора. Донорство ооцитов осуществляли согласно требованиям, предъявляемым к анонимным донорам ооцитов, а также при наличии письменного информированного согласия донора на проведение индукции суперовуляции и пункции яичников (Приказ Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г. №67 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия»).
Ооциты донора в количестве 4 были криоконсервированы в августе 2010 г. по методике мультипротекторной витрификации, разработанной в Клинике МАМА. Ооциты последовательно проводили по 4 растворам с восходящей концентрацией криопротекторов: этиленгликоль 3,75% — 15%; диметилсульфоксид 3,75% — 15%; фиколл 2,5%—10%, сахароза 0,125 — 0,5 М при температуре –37 °C. Время экспозиции в каждом растворе варьировало от 1 до 6 мин.
После экспозиции в последнем растворе криопротекторов ооциты помещали в систему HSV kit («CryoBioSystem», Франция) в количестве 2 штук.
Криоконсервацию осуществляли путем мгновенного погружения системы HSV в кипящий азот (–196°) с последующим хранением в сосудах Дьюара.
Все 4 ооцита анонимного донора были разморожены синхронно с циклом ЗГТ пациентки. В ходе разморозки ооциты последовательно проводили по 4 растворам сахарозы с нисходящей концентрацией (1 М — 0,125 М) при температуре –37 °C. Оплодотворение ооцитов осуществляли спустя 3 ч после размораживания методом ИКСИ с использованием спермы анонимного донора криобанка. Было получено два эмбриона, культивирование эмбрионов осуществляли в течение 120 ч. К моменту переноса оба эмбриона достигли стадии бластоцисты (3АА, 3ВА по классификации Гарднера) и были перенесены пациентке. На 14-е сутки после переноса эмбрионов в крови пациентки выявлено содержание β-чХГ в концентрации 780 мЕД/мл, а на 21-е сутки после переноса в полости матки методом УЗИ визуализировано одно плодное яйцо, соответствующее 5—6 акушерским неделям беременности. Поддержку 2-й фазы цикла и ранних сроков беременности проводили с применением препаратов утрожестан, прегнил и прогинова. В сроке беременности 12 нед пациентке была рекомендована консультация генетика. По результатам генетического скрининга генетический риск не превышал общепопуляционный. Оперативное родоразрешение пациентке произведено в плановом порядке на сроке 39—40 нед беременности 7 июня 2011 г. Родилась живая доношенная девочка, масса тела 3130 г., длина 54 см, оценка по шкале Апгар 8/8 баллов.
Настоящий случай показывает возможность успешного использования разработанного нами метода мультипротекторной витрификации для криоконсервации ооцитов человека как в рамках лечения бесплодия методом ЭКО, так и для создания криобанка яйцеклеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Al-Hasani S., Diedrich K., Van der Ven H. et al. Cryopreservation of human oocytes. Human Reprod 1987; 2: 695—700.
2. Bernard A., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives. Hum Reprod Update 1996; 2: 3: 193—207.
3. Boiso I., Marti M., Santalo J. et al. A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum Reprod 2002; 17: 7: 1885—1891.
4. Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet 1986; 1: 884—886.
5. Cobo A., Domingo J., Pérez S., Crespo J., Remohí J., Pellicer A. Vitrification: an effective new approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients. Clin Transl Oncol 2008; 10: 5: 268—273.
6. Cobo A., Meseguer M., Remohí J., Pellicer A. Use of cryo-banked oocytes in an ovum donation programme: a prospective, randomized, controlled, clinical trial. Hum Reprod 2010; 25: 9: 2239—2246.
7. Cobo A., Rubio C., Gerli S. et al. Use of fluorescence in situ hybridization to assess the chromosomal status of embryos obtained from cryopreserved oocytes. Fertil Steril 2001; 75: 354—360.
8. Coticchio G., Bromfield J.J, Sciajno R. et al. Vitrification may increase the rate of chromosome misalignment in the metaphase II spindle of human mature oocytes. Reprod Biomed Online 2009; 19: Suppl 3: 29—34.
9. Gook D., Osborn S., Johnston W. Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the configuration of the meiotic spindle. Hum Reprod 1993; 8: 1101—1109.
10. Grifo J., Noyes N. Delivery rate using cyropreserved oocytes is comparable to conventional in vitro fertilization using fresh oocytes: potential fertility preservation for female cancer patients. Fertil Steril 2010; 93: 391—396.
11. Isachenko E.F., Nayudu P.L. Vitrification of mouse germinal vesicle oocytes: effect of treatment temperature and egg yolk on chromatin and spindle normality and cumulus integrity. Hum Reprod 1999; 14: 2: 400—408.
12. Jain J. et al. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2005; 86: 4: 1037—1046.
13. Katayama K., Stehlik J., Kuwayama M. et al. High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertil Steril 2003; 223—224.
14. Kim T.J., Hong S.W. Successful live birth from vitrified oocytes after 5 years of cryopreservation. J Ass Reprod Genet 2010.
15. Kuleshova L., Gianaroli L., Magli C. et al. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 1999; 14: 12: 3077—3079.
16. Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M. Sugars exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have low toxicity to embryos and oocytes. Cryobiology 1999; 38: 2: 119—130.
17. Mandelbaum J., Anastasiou O., Levy R. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004; 113S: S17—S23.
18. Mandelbaum J., Junca A.M., Plachot M. et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes. Hum Reprod 1988; 3: 1: 117—119.
19. Manipalviratn S., Decherney A. Clinical application of human oocyte cryopreservation. Rev Recent Clin Trials 2008; 3: 2: 104— 110.
20. Noyes N., Labella P.A., Grifo J., Knopman J. Oocyte cryopreservation: a feasible fertility preservation option for reproductive age cancer survivors. J Ass Reprod Genet 2010; 27: 8: 495—499.
21. Noyes N., Porcu E., Borini A. Over 900 oocyte cryopreservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies. Reprod Biomed Online 2009; 18: 6: 769—776.
22. Porcu E. Freezing of oocytes. Curr Opin Obstet Gynecol 1999; 11: 3: 297—300.
23. Potapov M., Zaeva V., Shafei R., Krivokharchenko I., Zaletov S. IVF children after vitrification. Abstracts of the 22nd Annual Meeting of the ESHRE. Prage (Czech republic) 2006.
24. Scaravelli G., Vigiliano V., Mayorga J.M. et al. Analysis of oocyte cryopreservation in assisted reproduction: the Italian National Register data from 2005 to 2007. Reprod Biomed Online 2010; 21: 4: 496—500.
25. Shafei R., Zaeva V.,Krivokharchenko I., Isaev D. Vitrification of human embryos using hyaluronan-based protocol: clinical outcome of 118 cycles. Abstracts of the 20th Annual Meeting of the ESHRE. Human Reprod 2004; i136.
26. Tao T., Zhang W., Del Valle A. Human oocyte cryopreservation. Curr Opin Obstet Gynecol 2009; 21: 3: 247—252.
27. Yoon T.K., Kim T.J., Park S.E., Hong S.W., Ko J.J., Chung H.M., Cha K.Y. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 2003; 79: 6: 1323—1326.
28. Заева В.В., Кривохарченко И.С., Потапов М.Е., Сухачева Т.С., Шафеи Р.А. Роды после ЭКО с переносом витрифицированных эмбрионов (описание случая). Пробл репрод 2003; 2: 63—64.